Les viroïdes

Abstract

Les viroïdes sont des molécules d’ARN de petite taille capables de se reproduire dans les cellules végétales sans produire de protéines. Ils peuvent provoquer des maladies des végétaux et leur biologie moléculaire, en particulier leur activité enzymatique, les désigne comme les survivants d’un monde pré-cellulaire où l’évolution ne concernait que des populations moléculaires.

Les viroïdes

virus minima ou survivants du monde à ARN ?

Découverte

L’existence des viroïdes commença à être suspectée lorsque le spécialiste des maladies végétales T. O. Diener rechercha l’agent causal de la maladie des tubercules fusiformes de la pomme de terre. (Diener & al, 1967). Il mit en évidence que cet agent avait les propriétés d’un acide nucléique “libre”, sans lien avec des protéines. Ce nouveau type d’élément pathogène était si petit que, comme Diener le reconnait “beaucoup de scientifiques ont initialement douté de son existence” (Diener, 2003). La preuve de leur nature infectieuse n’a été obtenue qu’en 1972, lorsque des infections expérimentales purent être réalisées (Diener, 1972), ce qui motiva l’étude de ces acides nucléiques étranges tant au niveau de leur structure secondaire et de leur morphologie (Sogo et al, 1973) que de leur séquençage (Gross et al,1978), rendu possible à l’époque par la taille minime de ces agents pathogènes d’un nouveau genre.

Une première définition 

Les Viroïdes sont des molécules d’Acide Ribo Nucléque (ARN) de 50 nm de long environ (comportant entre 250 et 350 nucléotides), qui adoptent une structure secondaire le plus souvent circulaire, faisant alterner de courts segments à doubles brins et des boucles plus lâches. Ils sont autoreplicants et capables de provoquer des pathologies (principalement au niveau de la croissance végétale) par répression de certains gènes, dont ils perturbent ou bloquent l’expression par interférence. L’accumulation de viroïdes perturbe les voies normales du développement (Flores R, 2004).

Symptômes et contamination des végétaux

La plupart des viroïdes ont été découverts parce qu’ils déclenchent des maladies touchant de nombreuses plantes cultivées (avocats, cocotiers, pommes de terre, vigne, tomate…). Il est possible qu’il en existe de nombreux autres demeurant ignorés, car touchant des végétaux sans intérêt économique. Parmi les végétaux infectés connus, les dicotylédones prédominent (seules 2 monocotylédones, le cocotier et le palmier à huile, sont infectés).

Les premiers viroïdes découverts, identifiés chez la pomme de terre, provoquent les symptômes suivants:

-modification de la position et de l’aspect (vertical, rugueux, frêle, vert sombre) du feuillage avec enroulement vers le haut des feuilles terminales

– accumulation  de pigments en haut des tiges.

– prolifération des bourgeons axillaires

– diminution de la taille de la plante

– tubercules de petite taille, cylindriques et allongés, fuselés ou en forme d’haltère, d’aspect noueux et crevassé, impropres à la consommation. Ce symptôme a donné son nom à la maladie (tubercules fusiformes)

– réduction du nombre de tubercules produits 

– ralentissement de la germination

Il existe, dans une espèce viroïde, des variations aboutissant à définir des souches virulentes et d’autres bénignes. Les viroïdes sont classés à partir des motifs structuraux conservés de leurs séquences. On considère, arbitrairement, qu’une nouvelle espèce nécessite un taux de similitude < 90 % (il existe une dizaine de viroïdes “non classés” de façon précise). Les viroïdes sont nommés d’après les initiales de la maladie qu’ils provoquent suivie des lettres “vd” pour “viroid”. Les maladies sont nommées d’après leurs symptômes (maladie des tubercules fusiformes des pommes de terre, exocorticose des citronniers, marbrure chlorotique des chrysanthèmes…).

On connait actuellement une trentaine de viroïdes différents. La plupart sont spécifiques d’une seule plante, mais quelques-uns peuvent infecter les différents membres d’une famille (ainsi, le CCCvd infecte 5 espèces de  palmiers, le PSTvd peut infecter des solanacées, dont les tomates (Singh, 1973), mais aussi les avocatiers, les patates douces (Salazar, 1989) et plusieurs composées alors que le CEvd infecte plusieurs espèces de citronniers, mais également des composées, des tomates, des haricots et des carottes).

Leur principal effet (outre la décoloration des feuilles ou la présence de taches sur les fruits) est une perte de productivité agricole (diminution de rendement de l’ordre de 40% chez la pomme de terre et, dans les affections les plus graves, mort de la plante) pouvant se révéler extrêmement dommageable économiquement. Ainsi, l’infection viroïdaire des semences de pomme de terre produites par les agriculteurs de l’Île-du-Prince-Édouard, au Canada, a conduit les autorités sanitaires américaines à envisager un embargo alors que le commerce des semences canadiennes représente 250 millions de $ chaque année.

La réplication des viroïdes est favorisée par une augmentation de la durée du jour et de la température, ce qui contribue à expliquer qu’ils soient principalement impliqués dans des pathologies concernant des plantes tropicales, méditerranéennes ou élevées sous serre (Coden, 2001) et que les symptômes soient plus graves en période de climat sec et chaud.

Voies de la contamination et traitement

La contamination des plantes pourrait être réalisée par les pucerons (Werner-Solska, 1983). Toutefois, il apparait que le simple contact mécanique avec un viroïde, qu’il soit  transporté sur un outil, un véhicule, ou infectant une plante voisine, suffit à transmettre l’infection. Cela indique clairement que ces simples molécules d’ARN possèdent une résistance aux conditions du milieu tout à fait inhabituelle pour des acides nucléiques, molécules considérées habituellement comme étant extrêmement fragiles.

La transmission des viroïdes peut également s’effectuer à partir de plantes sauvages, infectées de façon endémique. Ils peuvent être transmis, en dehors de tout contact mécanique, par les pollens ou les ovules (ce qui fait des viroïdes des agents de maladies “sexuellement” transmissibles !)

L’infection d’un végétal se déroule en plusieurs étapes: pénétration dans la cellule par une voie inconnue, déplacement vers le site de réplication, invasion de la cellule par les réplicants et contamination des cellules voisines, de proche en proche, et d’organe en organe jusqu’à infection de toute la plante. 

Il semblerait que les viroïdes progressent de cellule en cellule au niveau des plasmodesmes. Ils empruntent aussi les vaisseaux, un viroïde passant ainsi, via le phloème, d’une feuille contaminée vers les tissus en croissance (Palukaitis, 1987). Ainsi, les viroïdes Pospiviroidae se déplacent à longue distance dans le phloème,  en formant probablement un complexe avec la RNA-binding phloem protein 2 (PP2), impliquée par ailleurs dans les mouvements et les translocations de gènes se produisant au cours de greffes (Ding et al, 2005; Gómez & Pallás, 2004). Toutefois, il semble que les viroïdes ne puissent se déplacer que dans des cellules matures, les méristèmes n’étant souvent que peu ou pas infectés. Cependant, des infections peuvent être transmises par les graines chez la tomate (entre 9 et 11% sont alors contaminées), ce qui implique une invasion des pièces génitales comme les ovules ou le pollen (Weidemann, 1987). Chez la pomme de terre, les viroïdes se concentrent principalement au niveau des poils foliaires, des feuilles supérieures et des tubercules. 

Il n’existe aucun traitement contre les infections viroidaires, si ce n’est la destruction des plantes contaminées. Toutefois, si cette solution est envisageable pour des cultures annuelles, il n’en est pas de même pour des végétaux pérennes comme les arbres fruitiers. De plus, tous les viroïdes ne sont pas pathogènes: le viroïde latent du houblon (HL-Vd) serait ainsi présent, asymptomatiquement, dans de nombreuses plantes d’espèces différentes à travers le monde. Certains viroïdes possèdent même un intérêt agricole: des citronniers nains peuvent être obtenus grâce à l’action d’un viroïde.

La recherche, limitée à quelques équipes principalement espagnoles et canadiennes, se focalise sur la mise au point de test de dépistage et d’inhibiteurs se liant aux ARN viroidaires. 

Une biologie moléculaire hors du commun

Il existe deux familles très différentes de viroïdes qui partagent les caractères suivants, qui les différencient des virus:

– les ARN viroïdes sont répliqués par des transcriptases cellulaires DNA dépendantes “détournées” de leur fonctionnement normal.

– ils existent à l’intérieur des cellules en tant que molécules d’ARN uniquement, sans synthèse de capside ou d’enveloppe.

– ils sont formés d’un seul ARN circulaire contenant entre 246 et 399 nucléotides (masse de 80 à 125 KDa). Ces ARN comprennent une forte proportion de liaisons G-C (53 à 60%) 

– ils ne codent dans la majorité des cas pour aucune protéine. Un viroïde atypique, celui du sunblotch de l’avocatier, ASB-Vd, serait codant, tout comme l’agent delta de l’hépatite D (voir plus loin).

-  l’ARN des viroïdes se recopie dans des organites à double membrane (noyau ou chloroplaste selon le groupe) alors que les virus recopient leur ARN dans le cytoplasme ou le noyau.

Des acides nucléiques particulièrement résistants

L’ARN circulaire se replie et s’apparie partiellement: la structure secondaire d’un viroïde est un mélange d’hélices et de boucles, car leur séquence est un palindrome imparfait. De longues régions complémentaires bicaténaires espacent les “boucles”. Leur forme est susceptible de passer par plusieurs conformations dans les cellules, en liaison avec leurs fonctions à ce moment-là.

Leur compacité les rend très résistants aux enzymes de dégradation (nucléase et RNases), ce qui est plus qu’inhabituel pour des ARN, ainsi qu’aux facteurs physiques: si on prend l’exemple du PST-Vd, la dénaturation ne commence qu’à 55°C à pression atmosphérique, et n’augmente fortement qu’après 65°C (Hadidi & al., 2003)

Deux familles “infectant” les noyaux ou les chloroplastes

    On distingue deux groupes de viroïdes :

– les pospoviroidae (ou groupe A), majoritaires (31 espèces), comprennent des espèces a réplication nucléaire possédant une région centrale identique (CCR) et différents domaines caractéristiques. Leur structure secondaire leur confère une forme en  paillette sur laquelle on identifie 5 domaines différents. Deux domaines terminaux gauche et droit (Tl et Tr, conservés, en boucle TCH ou linéaire TCR) encadrent la région C (Centrale) contenant des motifs fortement conservés (CCR) qui jouerait un rôle pendant la réplication, assurant le clivage et la ligation chez PTSVd (Góra-Sochacka, 2004).

La région C est flanquée du domaine P (Pathogénèse),  dont la séquence varie selon  la “virulence” de la souche (sévère ou atténuée pour le PSTVd et CEVd), et du domaine V (Variable). L’ensemble est donc organisé ainsi:

Tl-P-C (avec CCR)-V-Tr 

Ces viroïdes sont dépendants, pour leur clivage, des RNAses de leur hôte et possèdent une structure secondaire en tige faisant alterner des régions double brin séparées par des boucles simples brin. 

Séquence complète du viroide PST: l’ARN se replie sur lui même sauf au niveau des séquences non appariées qui forment des boucles. Schéma M. Price Ball, étudiante à Harvard.

– les asunviroidae (ou groupe B), regroupent quatre viroïdes à réplication chloroplastique, possédant des séquences à activité autocatalytique intervenantes au cours de leur réplication. Ces zones sont des ribozymes “en tête de marteau”, (les plus courts des ribozymes connus) existant aussi sur des ARN satellites de virus végétaux. Ils ne possèdent pas de région centrale CCR. Ce sont les seuls pathogènes connus capables de pénétrer et de se reproduire dans les chloroplastes.

La structure secondaire de ces viroïdes est le plus souvent circulaire, mais deux espèces (infectant les pêchers et les chrysanthèmes) possèdent une structure secondaire ramifiée, comportant plusieurs boucles et “épingles à cheveux” (Hernández & Flores,1992; Bussière et al, 2000; Gago et al, 2005).

Déroulement d’une infection

Après pénétration de la cellule, le transport vers le noyau, indépendant de l’hydrolyse du GTP, est réalisé spécifiquement par un facteur encore inconnu. En effet, même des ARN viroïdes de synthèse (presque le premier être “vivant” synthétique) se dirigent rapidement vers le noyau alors que les ARN de même taille restent habituellement dans le cytoplasme.

  Dans le noyau, les viroïdes peuvent se répartir dans le nucléoplasme ou se concentrer au niveau du nucléole. Pour le PSTvd au moins, cette concentration pourrait être liés à un transport par une protéine cellulaire impliquée en temps normal dans le transport des ARNr 5S, avec lesquelles certains viroïdes possèdent des analogies structurales (régions formant des structures tertiaires semblables, fortement conservées dont d’une importance fonctionnelle majeure – Branch et al., 1985). En effet, il existe dans la séquence de ce viroïde (au niveau de la boucle terminale E) des motifs en boucles (réseau de liaisons non Watson Crick) qui sont également présents chez cet ARN ribosomial et sont impliqués dans sa synthèse et son transport du nucléoplasme vers le nucléole. Faut-il y voir une convergence évolutive où l’indice d’un ancêtre moléculaire commun ?

Après réplication, certains des viroïdes réplicants sortent du noyau, en empruntant une voie inconnue, alors que d’autres y demeurent.

Des séquences correspondant à des motifs (donc des formes) spécifiques permettent le transfert des viroïdes d’une cellule à l’autre au travers des plasmodesmes. 

Les Viroides chloroplastiques (asunviroidae, avec ribozymes) peuvent aussi se répliquer dans les amyloplastes, les proplastes, les étioplastes et chromoplastes. Ils s’accumulent au niveau de la membrane des thylakoïdes.

La façon dont ils entrent et sortent du chloroplaste est totalement inconnue. Il est possible que le mécanisme permettant leur entrée soit voisin de celui utilisé pour pénétrer dans le noyau, et soit lié à l’existence d’une double membrane.

Les plantes mobilisent divers mécanismes de défense contre les viroïdes : les quantités de poly-amines, de protéines PR et d’éthylène sont modifiées pendant une infection.

Mode d’action

Les viroïdes agiraient en inactivant certains gènes à distance dans l’organisme végétal entier. Cette inactivation se produit selon les modalités du “RNA gene silencing”, les viroïdes étant inducteurs ou cibles de ce mécanisme (Itaya et al, 2001; Vogt et al, 2004). 

 L’inhibition de l’expression génique au moyen d’ARN de contrôle (RNA silencing).

Le RNA silencing est un mécanisme de contrôle de l’expression des gènes utilisé chez tous les eucaryotes. Il est caractérisé par l’action de petites molécules d’ARN (20 – 25 nucléotides), les short interfering (si) RNAs et micro (mi) RNAs.

Ces molécules sont fabriquées par une famille d’enzyme, les RNase III (Dicer) et sont ensuite recrutées dans un ensemble comportant plusieurs protéines, le RISC (RNA-induced silencing complex) qui inhibe spécifiquement la transcription de l’ADN ainsi que la traduction de l’ARN. 

(si)RNAs et (mi)RNAs sont à la source de cette spécificité, car ils fixent le RISC sur les séquences qui leur sont, totalement ou partiellement, complémentaires.

Schéma: La DICER se fixe sur un ARN double brin et le découpe en morceaux qui sont ensuite utilisés comme “détecteurs” par le complexe RISC pour identifier les ARN (dans l’exemple illustré) qui seront dégradés. Illustration M. Ruiz.

Origines de l’effet pathogène

C’est la région P (Keese & symons, 1985), pauvre en adénine, qui a pu être reliée tout d’abord à l’effet pathogène, mais d’autres résultats (Sano & al, 1992) indiquent que l’intégralité du viroïde peut se trouver impliquée. 

En effet, on trouve dans les tissus infectés par les viroïdes des deux familles des petits morceaux d’ARN (21 à 25 nucléotides) d’origine viroidaire qui ressemblent beaucoup aux petits ARN interférents (siRNA) intervenant dans les mécanismes de RNA silencing. Normalement, les siRNA sont obtenu par l’action d’une RNAse III (la DICER ou, chez les végétaux, la DCL = DICER like) sur un ARN double brin qui induit le mécanisme d’inhibition de l’expression génique. Les végétaux possèdent une DCL susceptible d’agir sur des ARN endogènes qui possèdent une structure secondaire en épingle à cheveux similaire à celle des viroïdes, pour donner des miRNA impliqués dans le contrôle de l’expression génique. Les viroïdes pourraient donc court-circuiter ce système et produire de “faux” miRNA aus effets délétères.

Chez les Pospiviroidae, les siRNA pourraient provenir des intermédiaires de la réplication, dans le noyau, ou des viroïdes complets se déplaçant dans le cytoplasme (ce qui est la seule possibilité pour les Avsunviroidae, car les mécanismes de RNAsilencing n’existent pas dans les chloroplastes). La RNA polymérase RNA dépendante que les végétaux utilisent pour le RNA silencing peut utiliser les siRNA comme amorce et l’ARN viroidaire comme modèle pour fabriquer de l’ARN double brin. 

Les siRNAs de différentes tailles détectés dans les cellules infectées sont générées par plusieurs voies différentes. Les ARN viroïdaires constituent dans la cellule une véritable population de taille variée pouvant influer à des niveaux multiples. Ainsi, leurs effets délétères ne sont pas liés à une médiation protéique.

Les petits ARN viroidaires agiraient comme les miRNA cellulaires, s’appairant à des ARNm (qui pour l’instant n’ont pas été identifiés), bloquant leur expression et causant ainsi les maladies observées (Papaefthimiou et al, 2001; Wang et al, 2004). Cela expliquerai pourquoi des changements mineurs de la séquence d’un viroïde peuvent aboutir à des modifications majeures de sa pathogénicité. On doit aussi considérer qu’il est possible que l’ARNviroidaire agisse directement sur un facteur (inconnu) de l’hôte de façon à provoquer les désordres constatés.

Ce mode d’action permet d’expliquer l’effet paradoxalement protecteur d’une accumulation d’infections. En effet, la “protection croisée” est une atténuation temporaire du nombre de viroïdes, ainsi que des symptômes de la maladie, produite par l’infection par une variété virulente survenant après une inoculation d’une souche moins pathogène du même viroïde ou d’une espèce très proche (de la Peña et al, 2002). Elle pourrait être causée par le RNA-silencing: les siRNAs provenant de la source peu pathogène se lieraient à ceux de la souche pathogène, qui leur ressemble beaucoup, réalisant ainsi un marquage de ces derniers qui aboutirait à leur dégradation, et donc à l’atténuation des symptômes constatés.

On se demande toutefois comment les viroïdes échappent aux effets défensifs de RNA silencing de leur hôte. Les virus codent des protéines qui inhibent différentes étapes de la voie du RNA silencing, mais les viroïdes ne disposent pas de l’arme protéique. La forme de l’ARN viroidaire lui permettrai d’échapper à cette voie de dégradation et aurait été obtenue par pression de sélection causée par cette dernière. (Wang et al, 2004). Cette forme (et donc la séquence correspondante) correspondrait à un compromis  entre la résistance au DCL, qui agit sur des structures secondaires compactes, et celle au RISC, qui agit sur des structures linéaires. L’association possible avec des protéines de l’hôte et les effets protecteurs des membranes des organites où se concentrent les viroïdes constituent également des moyens de protection contre les défenses de l’hôte.

Reproduction

Les viroïdes, bien que constitués uniquement d’ARN, ne codent pour aucune protéine. Ces agents infectieux étant uniquement de nature nucléique, ils agissent dans le monde des gènes. Ils détournent le protéome cellulaire à leur avantage, pour se reproduire, mais aussi se déplacer.

Pendant leur réplication, ils adoptent des structures secondaires, métastables, en épingle a cheveux, préservées dans différents types de viroïdes, ce qui signale leur importance.

L’utilisation de divers inhibiteurs des RNA polymérases (α-amanitine) a permis de montrer que c’est la RNA polymérase II qui est impliquée dans la réplication des viroïdes (Warrilow & Symons, 1999). Cette enzyme est donc détournée de son rôle physiologique (synthèse d’ARNm à partir de l’ADN). Les chercheurs ignorent encore les modalités de ce détournement enzymatique, qui pourrait être lié à la présence de séquences spécifiques (créant une forme spécifique ?) initiant la transcription et signalant sa fin. Certains viroïdes (ASB-Vd) semblent utiliser la RNA pol d’origine chloroplastique codée par le noyau cellulaire (nuclear-encoded chloroplastic RNA polymerase – NEP), qui ressemble à une RNApol bactérienne. On doit remarquer que cette polymérase, résistante à la tagetitoxine, présente également une similarité structurale avec les RNApol des phages T3 et T7. Dans le chloroplaste, plusieurs polymérases pourraient donc être impliquées dans la synthèse des réplicants.

 La reproduction des viroïdes utilise un mécanisme par “cercle roulant”  (Schéma montrant le principe de la reproduction par cercles roulants: la séquence circulaire est recopiée à volonté. Schéma M. Price Ball, étudiante à Harvard) s’effectuant en 2 temps, selon 2 voies différentes pour les deux familles principales de viroïdes, avec des formes intermédiaires principalement constituées de RNA (Branch & Robertson 1984, 1985).

Toutefois, les deux voies de reproduction présentent les éléments communs suivants:

– synthèse de brins de longueur très supérieure à l’original par une RNA polymérase DNA dépendante détournée de sa fonction et “forcée” à transcrire de l’ARN à partir d’ARN.

– découpage de ces précurseurs, de façon autocatalytique ou pas.

– soudure (par une ARN ligase cellulaire ou autocatalysée) des extrémités et repliement pour former un nouvel “individu” circulaire (Flores, 2004).

On peut aussi remarquer que la forme circulaire des viroïdes leur permet de ne pas posséder de séquences spécifiques  signalant le début et la fin de la réplication, laquelle se déroule donc en continu.

Réplication des Pospiviroidae (dans le noyau cellulaire)

Ils utilisent une voie de reproduction dite asymétrique.

Le viroïde, dit cercle +, est recopié par une RNA polymérase RNA dépendante cellulaire. On obtient un ARN linéaire qui est le “négatif ”  de la séquence infectieuse. Le brin obtenu est ensuite recopié par les enzymes cellulaires, redonnant un brin “+”  qui  se circularise pour donner un nouveau viroïde. Le clivage est réalisé par une RNAse, la soudure par une RNA ligase cellulaire.

Les brins positifs, au niveau nucléaire, sont transportés jusqu’au nucléole, où les précurseurs des ARNt et ARNm sont aussi exportés. Tout se passe comme si un récepteur spécifique à ce brin existait dans le noyau, assurant un transport des brins indépendant du cytosquelette et distinct du Cycle Ran GTPase dépendant qui assure le transport nucléaire de beaucoup de protéines et d’acides nucléiques (Woo et al, 1999; Zhao et al, 2001).

Réplication des Avsunviroidae  (dans les chloroplastes)

La RNA polymerase créé une longue copie “négative” de l’ARN viroidaire. Cette copie “-” contient des séquences à activité enzymatique, des ribozymes, qui catalysent sa formation. Ces ribozymes en “tête de marteau” se forment transitoirement pendant l’élongation du brin, l’emplacement du site d’initiation de la copie étant crucial pour la formation du ribozyme lui-même (Delgado et al., 2005), plusieurs ribozymes devant s’associer pour être actifs (Forster et al, 1988).

Les ribozymes viroidaires découpent l’ARN en morceaux. Ce n’est pas là une réaction d’hydrolyse,  car le nombre de liaisons phosphodiester est maintenu et la réaction de transestérification est ,théoriquement, réversible. La réaction de coupure est une attaque nucléophilique d’un 2′-hydroxyle sur un phosphate au site de coupure. Les fragments obtenus possèdent des extrémités 2′,3′-phosphate cyclique et 5′-hydroxyle.

Le brin négatif restant reprend sa forme circulaire et est recopié en un brin +. C’est alors que le ribozyme (-) intervient encore, en découpant le long brin + pour donner des unités qui, se refermant sur elles-mêmes, donnent de nouveaux viroïdes. Ce type de réplication ne nécessite qu’une RNApol cellulaire, c’est donc une voie principalement basée sur les propriétés de l’ARN en tant que génome et enzyme. Ainsi, il semble bien que la soudure des brins +, pour former des boucles, soit réalisée automatiquement par l’ARN lui-même ou sa partie ribozyme (une RNA ligase pourrait intervenir, mais cette molécule n’a jamais été mise en évidence dans le chloroplaste où se passe la réplication). En effet, cet autoassemblage au moyen d’une liaison phosphodiester 2′,5′ à déjà été observée chez le viroïde PLM. 

Les ribozymes des viroïdes sont bien plus simples que ceux identifiés chez certains eucaryotes où ils réalisent l’excision des introns lors de la transcription. Leurs séquences sont les plus courtes connues possédant une activité catalytique.

Dans les deux familles de viroïdes, le brin négatif n’est donc pas qu’un simple intermédiaire: il présente des propriétés spécifiques, et pas seulement au niveau de la formation des ribozymes, pour les enzymes cellulaires qui se lient à lui.

Origine évolutive et phylogénie éventuelle

Plusieurs hypothèses ont été avancées concernant l’origine des viroïdes: composantes d’origine cellulaires asymptomatiques provenant de plantes sauvages, transposons ou introns devenus autonomes, ARN “signaux” impliqués dans des échanges de matériel génétique entre cellules dévoyés de leur fonction ou (et c’est la piste à la fois la plus probable et la plus fascinante) reliques du monde à ARN ayant été à l’origine de la vie actuelle sur notre planète.

Nombreuses sont les données en faveur d’une origine ancestrale des viroïdes :

– les structures autocatalytiques viroïdaires sont beaucoup plus simples et plus petites que les ribozymes excisant les introns de certains eucaryotes, un motif de 19 nucléotides suffisant pour former un ribozyme actif et spécifique

– leur faible taille et leur taux élevé en G-C favorisent la stabilité des molécules (à la fois en diminuant le risque d’erreurs de transcription et en rendant l’ARN lui même physiquement plus résistant) et peuvent résulter d’une origine abiotique.

– la réduction des risques d’erreurs par les polymérases primitives

– l’absence de séquences d’amorçage et de terminaison, rendue possible par leur forme circulaire  

Il est donc possible que nous soyons en présence de reliques du monde ARN devenues parasites des eucaryotes et même des virus! Ces derniers peuvent en effet présenter des ARN satellites de type virusoides. Ainsi, des virus à ARN touchant les végétaux comme Sobemovirus, Polerovirus et Nepovirus sont “accompagnés “ d’ARN “satellites” qui ressemblent fortement à des viroïdes (présence de séquences en “tête de marteau”, comme les ribozymes). 

Toutefois, l’existence de capacités autocatalytiques, réservées à une famille de viroïdes, inconnues chez les virus est un argument solide en faveur d’une origine extrêmement lointaine des viroïdes, qui seraient donc totalement indépendants des virus au plan phylogénique. Les rétrovirus (utilisant de l’ARN) sont des parasites de la traduction alors que les viroïdes se comportent, eux, en parasites de la transcription: la logique évolutive de ces deux modes de fonctionnements n’est pas la même. 

Il est cependant possible que les deux modes de reproduction des viroïdes soient liés à deux origines évolutives différentes. Ainsi, la spécialisation des Avsunviroidae dans l’exploitation des chloroplastes pourrait signaler qu’ils sont les descendants de formes de vies infectant les bactéries photosynthétiques ancêtre des chloroplastes avant que celles-ci ne deviennent des organites des cellules eucaryotes. 

Toutefois, cette spécialisation n’est peut être qu’une relique d’une histoire évolutive bien plus riche: expérimentalement, une équipe de chercheuses de l’université Pierre et Marie Curie (Delan-Forino & al., 2011) a montré que le viroide ASBVd (qui provoque le ”sunblotch” de l’avocatier), de la famille des Avsunviroidae, peut se répliquer dans les cellules de la levure Saccharomyces cerevisiae. C’est la première preuve expérimentale qu’un viroide peut «infecter» une autre organisme qu’une plante. 

Il faut noter cependant que les mécanismes de «vérification» des ARN de la levure détectent les viroides comme étant anormaux, et un certain pourcentage de ces derniers est donc détruit. 

Ces travaux montrent que les viroïdes, même s’ils ne sont in vivo connus que chez les plantes (en excluant l’agent delta), ont in vitro la capacité d’utiliser à leur profit la machinerie moléculaire d’autres types de cellules. Ils font donc preuve d’une adaptabilité remarquable aux différents «milieux» biochimiques cellulaires.  On peut analyser cette adaptabilité comme la trace d’une ancienne universalité des viroides, aptes à intégrer tous les types cellulaires pour la simple raison qu’ils constituèrent, au début de la vie, une des premières formes de répliquants à l’origine des divers types cellulaires actuels.

La comparaison des séquences révèle des parentés insoupçonnées.

L’analyse des séquences (Elena, 1991) montre que les viroïdes et les ARN satellites constituent un groupe monophylétique (même ancêtre) comprenant deux familles, celle des deux types de viroïdes proprement dits et celle des sARN. Les viroïdes seraient donc la forme ancestrale des sARN (Diener TO, 1995). 

En couplant cette analyse à celle des mécanismes biochimiques de réplication, Bussière & al. (1995) suggèrent que le viroïde du pécher (PLM Viroid) soit un fossile moléculaire survivant du monde d’ARN, bien plus ancien que les premières cellules. Cette même équipe propose également un mode de réplication de ce viroïde minimisant l’utilisation de protéines, ce qui serait logique dans l’optique où cet “organisme” proviendrait d’un monde initialement sans protéines… A l’appui de cette thèse, la correspondance entre  les trois activités enzymatiques nécessaires à la réplication des viroïdes et des sARN (RNA polymérase ARN dependante, RNAse et RNA ligase) et celles pour lesquelles une activité ribozyme correspondante a été mise en évidence (Elena & al., 1991).

Des expériences de mutagenèse dirigée montrent que les viroïdes, sous l’influence de pressions de sélection, sont capables d’évoluer extrêmement rapidement, une quasi-espèce devenant dominante en quelques jours ou semaines. La plasticité de leur génome permet aux viroïdes d’être le plus rapide système biologique évolutif connu.

On peut également remarquer l’existence d’une analogie structurale entre les viroïdes et les ARNt des cellules eucaryotes. On retrouve chez ces deux ARN les mêmes motifs, boucles et lignes, organisés en “trèfles”. Cette convergence de forme peut être une simple homologie moléculaire, mais peut-être (et c’est là une idée personnelle) que les ARNt pourraient dériver des premiers ARN formés à l’aube de la vie. ARNt et viroïdes posséderaient alors un ancêtre commun. Toutefois, il existe actuellement de nettes différences entre des deux types d’ARN: les ARNt sont 3 fois plus courts (60 à 95 nucléotides) que les viroïdes et comprennent de la dihydro-uridine et de la pseudo-uridine qui n’existent pas chez ces derniers. Néanmoins, plusieurs observations permettent de conforter cette hypothèse:

– le motif “boucle E” initialement mis en évidence sur les rRNA 5S, est également présent dans le CCR des PSTVd et joue un rôle dans la ligature des brins (ci contre: structure “boucles et double brin” de l’ARN 5S de la bactéries E. Coli – on est très proche de la structure viroïdaire).

– Rétrovirus et viroïdes possèdent des motifs similaires à ceux retrouvés dans les ARNt

– le viroïde PSTV (Potato Spindle Tuber Viroïd) et l’ARNt de la tyrosine contiennent les mêmes motifs structuraux en « feuille de trèfle ». 

Pluralité des origines possibles

L’hypothèse la mieux étayée consiste à considérer les viroïdes comme des reliquats du monde précellulaire, du monde à ARN (Diener, 1989). Après le développement des formes de vies à ADN, les viroïdes auraient évolué pour parasiter certaines cyanobactéries, ancêtres des chloroplastes, puis les cellules eucaryotes elles-mêmes. La divergence des viroïdes en deux groupes (ou plus, car nous n’observons que les survivants les plus “visibles”…) aurait été causée par des mutations et des recombinaisons au cours de leur histoire évolutive mouvementée (Elena et al, 2001). Il est ainsi possible que les ancêtres des viroïdes se soient associés à des virus, et aient acquis secondairement leurs propriétés de parasites des cellules végétales (Coden, 2001).

Une autre voie possible est de considérer que les viroïdes ont une origine endogène à la cellule eucaryote et proviennent de la circularisation d’introns excisés d’ARN prémessagers. C’était l’hypothèse première de leur découvreur, T.O. Diener (1981) mais des travaux plus récents et la découverte de l’activité enzymatique des ARN conforte plutôt l’hypothèse précédente, celle de structures survivantes de l’aube de la vie. Toutefois, certains chercheurs voient encore les viroïdes comme des introns dégénérés (cahiers d’études et de recherches francophones, 2005)

Une structure viroidaire infectant les cellules animales: l’agent delta

Pour l’instant, aucune structure de type viroïde n’a été identifiée en tant que facteur pathogène dans des cellules animales (ce qui plaide en faveur d’une histoire évolutive comprenant un stade de parasitisme des chloroplastes). Toutefois, il existe au moins une molécule d’ARN, à effet pathogène, partageant certains points communs avec les viroïdes.

L’agent delta (ainsi nommé à cause de spécificité) n’infecte que les porteurs du virus de l’hépatite B.

A l’échelle mondiale, plus de 5 % des personnes infectées par le virus de l’hépatite B le sont aussi par l’hépatite D, soit plus de 20 millions de personnes infectées par le virus de l’hépatite D, qui est susceptible de déclencher des épidémies. Ce “virus” est également présent chez d’autres primates, avec de très légères différences de séquence.

Il a été mis en évidence sous l’acronyme VHD par M Rizzetto (1977) et, tout comme les viroïdes, il est constitué d’un ARN circulaire simple brin de 1679 nucléotides. Cet ARN donne naissance à une copie (”antigénome”) comportant une zone codante permettant la synthèse d’une protéine, l’antigène delta, qui se fixera ensuite à l’ARN viral (qui est d’ailleurs le plus petit génome de virus connu). L’antigénome sert de modèle pour la synthèse de plusieurs génomes complets, synthèse se produisant dans le noyau des hépatocytes. Comme il existe une grande complémentarité entre l’ARN delta et l’ARN 7S des hépatocytes, la liaison de l’ARN delta à cet ARN cellulaire provoque la destruction de l’ensemble et, partant, la mort des hépatocytes.

La partie du génome delta non codante se clive et se lie toute seule, par activité ribozyme (Chanberlain, 2000). Le génome de l’agent delta se repique donc selon le même mécanisme que les viroïdes (cercle roulant) et dans le même lieu mais, contrairement à ces derniers, il code une protéine. Cette molécule s’associe à deux de ses dérivés (p27D et p29D) pour former une première enveloppe (nucléocapside) qui ne permet pas à l’agent delta “encapsulé” de sortir de la cellule. Pour cela, il doit trouver, dans la même cellule, une enveloppe “clef en main” fournie par un virus d’hépatite, le VHB. Ces deux virus sont donc “associés”, et l’agent delta peut être décrit comme étant un parasite du virus VHB, dont il emprunte l’enveloppe pour se propager de cellule en cellule. 

Les points communs entre le VHD et les viroïdes posent le problème de l’origine de ce virus, car il apparaît comme étant plus près des virus végétaux que de ceux rencontrés le plus souvent dans les cellules animales.  En effet:

– La taille du VHD représente 3 à 7 fois celle des viroïdes, mais seulement le quart de la taille des plus petits virus humains

– Le génome du VHD présente des homologies de structure avec les viroïdes, comme sa richesse en liaisons guanidine-cytosine et des séquences communes d’appariement des nucléotides.

De nouvelles découvertes ont permis de résoudre, partiellement, l’énigme en liant le VHD à une nouvelle classe (comptant cinq éléments) d’agents pathogènes végétaux, les virusoïdes. Ils possèdent un court génome (220 à 388 nucléotides) non codant et se répliquent dans le cytoplasme, en présentant une activité autocatalytique. Leur réplication est similaire à celle des viroïdes, mais elle requiert la présence d’un autre virus, dit “helper” (un Sobemovirus), dont les enzymes facilitent la réplication de l’ARN virusoidaire qui se fera transporter comme un passager clandestin à l’intérieur de la capside de son “helper”.

Conclusion: le gène “nu”

Les viroïdes représentent une survivance moléculaire d’un temps pré-cellulaire, et nous montrent encore des indices de leur lointaine origine: leur résistance au milieu extérieur, leurs éventuelles capacités autocatalytique valident l’idée d’une étape “ARN” de l’histoire de la vie. Toutefois, leur comportement actuel de parasite des cellules végétales, et, sans doute, de parasite des ancêtres des chloroplastes, a dû contribuer à gommer nombre de leurs spécificités, dont les informations sur leur premier milieu de vie. Ainsi, il n’est pas possible de savoir si leur richesse en GC est l’indice d’une résistance à des températures élevées ou la résultante d’une sélection visant à résister à la dénaturation en dehors de la cellule, ou à  l’intérieur de celle-ci. La comparaison des ARN viroïdaires avec les nombreuses familles moléculaires d’ ARN récemment découvertes (ARN interférents ou satellites par exemple) mais également avec des organites complexes comme les ribosomes ou les chloroplastes, devrait permettre de préciser les conditions de leur origine et de remonter dans le temps, bien avant l’univers des cellules, vers une époque où les promesses de la vie se limitaient à voir croître, se reproduire et prospérer, sous des cieux étrangers, du fond de la complexité des molécules nouvelles…

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